轉(zhuǎn)基因動物的檢測

無論用哪一種方法制作轉(zhuǎn)基因動物,對獲得的動物都需要進行外源基因的整合和表達水平的檢測。在 GFP 等直觀的標(biāo)記基因發(fā)明之前,轉(zhuǎn)基因動物的檢測主要依賴分子雜交技術(shù)。即使是在標(biāo)記基因使用之后,分子檢測仍然是必不可缺的。基因分子檢測的基本原理是使用只同目標(biāo)基因的序列發(fā)生結(jié)合的探針進行分子雜交,從而探測出外源基因是否已經(jīng)整合到動物的基因組中。這是初步的整合檢測。如果深一步的研究,要了解整合的位點和整合的拷貝,還要進行外源基因的定位和整合拷貝數(shù)的測定。接下來,對于經(jīng)整合檢測已經(jīng)確認的轉(zhuǎn)基因動物,還要進行表達檢測。因為并非所有的轉(zhuǎn)基因動物都能表達目的基因的產(chǎn)物,即使有表達,其表達的水平也不盡相同。根據(jù)目的基因表達產(chǎn)物的不同,檢測的方法也有多種。

( 一 ) 整合檢測

1. 采樣及提 DNA

用于提取 DNA 供分子檢測的動物組織,一般是新生幼仔的耳或尾組織,逐頭采樣,編好號,剪成小塊,置于液氮中,凍結(jié)。也可以采血 5O～80μl(小鼠) 放入 DNA 抽提液中。

提取 DNA: 組織樣在液氮中磨碎;取 loomg 放人有 1.2ml DNA 抽提液的小管中,50 ℃溫育18h,并伴有輕搖。

(1)DNA 提取液

100m mol/L NaCI

10m mol/L Tris · Cl,pH8.0

25m mol/L EDTA,pH8.0

0.5%(w/v)SDS

100μl蛋白酶 K( 臨用前加入 2Oμl/ml 貯存液)

不含蛋白酶 K 情況下,DNA 提取液于室溫可以長期保存。

(2) 用等體積的酚/氯仿/異戊醇 (25:24:1)抽提樣品,重復(fù) 2 次,水相為 DNA 溶液(操作過程中需緩慢輕柔)。

(3) 加 2 體積無水乙醇,輕混。

(4) 用 tip 挑出紊狀 DNA,并在 75% 乙醇中洗一次,空氣干燥 , 然后溶解于含 0.1μmol/ml無 DNA 酶的RNA酶TE中,使 DNA 終濃度約為 1mg/m1,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

而對于希望能獲得非常好 Southern 結(jié)果的研究就需要下列 DNA 提取方案 :

1)100mg的碎組織樣放于1ml提取液中(0.5M EDTA,pH8.0,100μl蛋白酶 K,0.5%十二烷基磺酸鈉)。

2)50 ℃水浴 2Oh, 隔時輕輕轉(zhuǎn)動溶液。

3) 用等體積平衡酚緩和抽提3次,離心除酚及界面雜物(酚一般都處于下層)。

4) 將 DNA 液對 100 體積的溶液(5OmM Tris·cl,pH8.0,1OmM EDTA,1OmM NaCI) 透析換液多次,直到透析物 OD270 小于 0.050

5) 用終濃度為 100μg/ml 的無DNA 酶的 RNA 酶 37 ℃處理 3h。

6) 等體積酚氯仿混合液輕抽提2次。

7) 用TE充分透析樣品,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR 檢測

PCR 檢測的特點是快速、靈敏。不同的外源基因,根據(jù) PCR 引物設(shè)計的原則,設(shè)計并合成一對或數(shù)對引物(以便對引物篩選)。先摸索循環(huán)反應(yīng)的最佳條件之后,正式加樣進行 PCR擴增,電泳檢查,確定陽性的樣品。PCR 易出現(xiàn)假陽性,因此需要進一步驗證。

3. 斑點雜交 （Dot blot） 和 Southern 印跡雜交

對 PCR 擴增初選出來的陽性樣品,還應(yīng)進一步通過分子雜交來驗證。當(dāng)目的基因與內(nèi)源基因組 DNA 元同源性時,可用斑點雜交。但如基因拷貝數(shù)少或嵌合體時,也會有假陰性。當(dāng)目的基因與內(nèi)源基因組 DNA 有較高的同源性時,最好用 Southern 印跡雜交。這是由于在絕大多數(shù)情況下原代轉(zhuǎn)基因動物所攜帶的外源基因以隨機方式整合在基因組中,常常會有首尾相連的現(xiàn)象。以 Southern blot 分析便可了解整合方式,從本質(zhì)上與宿主的基因組同源區(qū)分開,而Dot bolt 無法做到這一點。

到目前為止,Southern 印跡雜交仍是公認的最可靠的分子檢測方法。進行 Southern 雜交時,底物中應(yīng)包括未曾酶解的大分子 DNA 和至少兩種限制性內(nèi)切核酸酶消化的 DNA 樣本,只有三種樣本都給出合理的結(jié)果,才能確認目標(biāo)基因確實已整合到基因組中。

4. 外源基因的定位一一染色體原位雜交

對確認的轉(zhuǎn)基因動物,為了研究整合位點與表型性狀、表達量之間的關(guān)系,需通過染色體的原位雜交,確定外源基因整合的位點。

鄧輝南等人建立的轉(zhuǎn)基因動物染色體原位雜交技術(shù)操作如下。

(1) 染色體的制備。以無菌手術(shù)采轉(zhuǎn)基因動物耳靜脈血,放入盛有肝素(1000u/ml) 的到水瓶中,搖勻,4 ℃靜置,使紅細胞沉降。取上層血漿層 0.5ml 接種于含有 PHA、青霉素、鏈霉素和20%胎牛血清的 RPMⅠ1640 5ml中。37℃培養(yǎng)6h后,加100μg/ml5'Brdu,繼續(xù)培養(yǎng) 12h。細胞經(jīng)洗滌后,重新懸浮在新鮮的含有2.5μg/m1 胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中,37 ℃再培養(yǎng) 6h。收獲前知聞

加入秋水仙素 0.04μg/ml。按常規(guī)方法制備外周血淋巴細胞染色體玻片標(biāo)本。置 4℃?zhèn)溆谩?/p>

(2) 探針標(biāo)記。對外源基因進行酶切,選取適當(dāng)?shù)钠?也可用全基因),將 Dig-11-dUTP用隨機引物法進行探針標(biāo)記,也可用同位素標(biāo)記制備探針。

(3) 變性與雜交。首先對染色體玻片標(biāo)本進行預(yù)處理,每張玻片加 100μl RNA 酶 (100μg/ml),蓋上蓋玻片,置于潮濕皿中,37 ℃,1h;去除蓋玻片,用 2 × SSC 洗片 5 次 SSC：NaCl(3mol/L)+ 高溫滅菌檸檬酸鈉(pH7.0,0.3mol/L)的混合溶液。再用乙醇(70% 、80%、90%、100%)逐級脫水,空氣干燥。然后探針與染色體共變性雜交: 在每張玻片上加雜交液 (1ng/μl 標(biāo)記探針,50% 甲酰胺,10% 硫酸葡萄糖,0.5mg/ml 硅魚精子 DNA,2 × SS)100μl,蓋上蓋玻片,72℃變性 lOmin,迅速置于碎冰上;將共變性的玻片置于潮濕皿中,42 ℃雜交16h。最后進行脫水處理: 雜交反應(yīng)的玻片用 50% 甲酰胺,2 × SSC 洗滌 5 次,每次 5min。

(4) 基因定位。將洗滌過的雜交玻片標(biāo)本在 PBS 中洗一次,去除多余的 PBS,但不使玻片完全干燥。在玻片上加 1Oμl膠體金標(biāo)記的抗 Dig 抗體,蓋上蓋玻片,室溫下反應(yīng)30min。用 PBS 洗滌一次,然后每次用 200ml 去離子水洗 5 次,以去除氯離子。在每張玻片上加新配制的銀增加試劑 100μ1,在潮濕皿中,室溫避光作用 3Omin。用去離子水洗滌數(shù)次以終止反應(yīng)。

(5) 染色體 G- 顯帶。用熒光 -Giemsa 則法進行染色體顯帶 : 在玻片上加5μg/ml Hoechst33258,室溫避光作用 30min,2 × SSC 洗滌 3 次,紫外燈照射 6Omin,用去離子水洗滌就此 10%Giemsa 染色劑 (用 0.06mol/L PB,pH6.8 稀釋)染色10min;用去離子水洗去多余的染色劑,自然干燥后鏡檢。

(6) 鏡檢與分析。泊鏡下選擇染色體數(shù)目完整、帶型清楚的中期相進行分析。只計數(shù)與染色體接觸的銀顆粒。最后進行統(tǒng)計分析,確定外源基因的整合位點。

5. 外源基因整合拷貝數(shù)的測定

測定外源基因整合的拷貝數(shù),對于轉(zhuǎn)基因動物整合機理和遺傳規(guī)律的研究,以及整合拷貝數(shù)與表型性狀表達關(guān)系的研究,具有重要意義。湖北省農(nóng)科院動物胚胎工程及分子育種實驗 室所建立的技術(shù)操作如下。

(1) 探針制備及標(biāo)記。酶切外源基因,取特異片段做探針,用隨機引物法進行同位素標(biāo)記。

(2) 組織樣 DNA 提取。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)及待測樣品系列制備。用 Dig-DNA 標(biāo)記檢測盒中的 PBR326 標(biāo)準(zhǔn) DNA(200μg/ml)稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列,所含 DNA 濃度從低到高依次為（pg/μl）:0.1,0.5,1.0,10, 20,30,40,50,60,100;取標(biāo)準(zhǔn) DNA, 待測樣品 DNA, 陰性對照非轉(zhuǎn)基因動物 DNA 各 3×6μl,置于 0.5ml的 EP 管中,將各管置于95～100℃水浴中變性 10min 后,迅速置于冰水中;變性之后,各管加 3×4μl SSC,3×6μl TE混合;將準(zhǔn)備好的纖維素膜裝入加樣品,點樣,每個點樣孔加入 DNA 溶液 15μl,每個樣品重復(fù) 3 次;點樣后抽真空,取出纖維素膜80℃烘干 2h。

(4) 雜交。將預(yù)雜交液預(yù)雜交6h,加入同位素標(biāo)記好的探針,于65 ℃搖床中雜交 24h;再用纖維素膜,先用洗膜液 1(2 × SSC,0.1SDS) 洗 2 次,每次 5mn;再用洗膜液 2(0.5 × SSC, 0.1%SDS) 在60℃下洗 2 次,每次15min;洗脫后的雜交膜晾干,按標(biāo)記部位將各樣品點剪下,分別裝入標(biāo)好號的液體閃爍記數(shù)杯中。

(5) 消化。纖維素膜裝好后立即向杯內(nèi)各加入60%高氯酸(HC104)300μl,30% 過氧化氫(H2O2)600μl,異丙醇1滴,加蓋,置于7O～80℃的恒溫培養(yǎng)器中消化1～2h。

(6) 樣品放射性測量。利用FJ-2101G 型雙道液體閃光計數(shù)器進行。消化后的樣品加10ml閃爍液 (PP0 6g),二甲苯 670μl,Tritonx 100～300μl,置避光處暗適應(yīng) 8～1Oh 以減少因化學(xué)發(fā)光而引起的計數(shù)誤差, 然后上機進行測量。

（7）拷貝數(shù)分析。按如下公式進行：

式中，N---每個細胞所含外源基因拷貝數(shù)；

    nc---待測樣品所含細胞數(shù)；

    Nc---液體閃爍計數(shù)度（CMP）

( 二 ) 表達檢測

1. 轉(zhuǎn)錄水平（RNA）的檢測

一般而言,轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)錄水平的檢測不主張開腹取樣,對于一些在特異器官或組織表達基因,開腹取樣會嚴(yán)重影響動物的健康。而淺表組織表達檢測采樣是可行的。進行 RNA 水平上的檢驗 ,Northern blot 對同源性較小的外源基因是首選方法;而對于同源性較高的外源基因,轉(zhuǎn)錄水平的檢測可以參考用 RT-PCR 法。Northern 雜交的底物是RNA,與探針進行 RNA/DNA 雜交。底物可以是從不同組織提取的總 RNA,也可以是經(jīng)過純化的總的 mRNA 。進行Northern 雜交時,需要在抑制RNA酶活性的條件下進行電泳分離和雜交,一般不需要將 RNA酶解成片段。如果 Northern雜交的結(jié)果是陽性,也可以反過來佐證已成功地獲得了轉(zhuǎn)基因動物。

2. 翻譯水平 ( 蛋白質(zhì) ) 的檢測

轉(zhuǎn)基因動物的最終目的是獲得表達產(chǎn)物,所以翻譯水平的檢測結(jié)果是轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建是成功的關(guān)鍵指標(biāo)。表達產(chǎn)物檢測就是檢查目標(biāo)基因編碼的蛋白質(zhì),大致需要分四步進行。

第一步,要從表達基因的靶組織提取總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,觀察有無分子質(zhì)量與目標(biāo)產(chǎn)品相同的新蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)。如果已知產(chǎn)品表達量很低,常規(guī)的電泳不易觀察到,還要用放射性同位素標(biāo)記新合成的蛋白質(zhì),電泳后轉(zhuǎn)移到感光膜上觀察基因表達情況。

第二步,如果看到了分子質(zhì)量與目標(biāo)產(chǎn)品相同的新蛋白質(zhì)條帶 , 就要對它進行定性研究,方法是進行 Western blot, 將凝膠上所有蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到雜交膜上,用目標(biāo)產(chǎn)品的特異揣 進行雜交。也可以用 EUSA 的方法來檢測,它的原理也是抗原/抗體親和性測定。

第三步,如果目標(biāo)產(chǎn)品已被確定,要進一步對它的末端氨基酸排列進行測定,看一看是否與天然蛋白質(zhì)相同 。

第四步,如果產(chǎn)品的生物活性決定著產(chǎn)品的價值,要對產(chǎn)品進行生物活性測定。產(chǎn)品生物活性測定,則要根據(jù)蛋白質(zhì)的種類選擇不同的測定方法。