微RNA-887-3p能抑制大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞中MDM4表達和細胞增殖并促進細胞凋亡

目的 探討微RNA （microRNA，miRNA或miR） -887-3p對大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞增殖和凋亡的影響及其 潛在的分子機制。

方法 取8周齡SPF級雄性SD大鼠的纖維環(huán)組織，離心制備并鑒定纖維環(huán)細胞。實驗隨機分為4 組：正常組 （Normal group） 是不做任何處理的原代纖維環(huán)細胞；對照組 （Control group） 用10 ng/mL白細胞介 素-1β （interleukin-1β，IL-1β） 處理纖維環(huán)細胞24 h，形成退變細胞模型；干擾組 （miR-887-3p inhibitor） 是在對 照組的基礎上用 Lipo3000 轉染 miR-887-3p 抑制子；過表達組 （miR-887-3p mimics） 是在對照組的基礎上用 Lipo3000轉染miR-887-3p模擬物。采用CCK-8法檢測各組細胞活力；流式細胞術檢測各組細胞凋亡率；實時熒光 定量PCR法檢測miR-887-3p和鼠雙微體4 （murine double minute 4，MDM4） mRNA的表達；蛋白質印跡法檢測 MDM4、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表達水平。

結果 免疫熒光染色法鑒定分離培養(yǎng)的細胞發(fā)現(xiàn)，大鼠椎間盤纖維 環(huán)細胞中Collagen I的陽性率在90%以上，提示纖維環(huán)細胞純度大于90%。實時熒光定量PCR結果顯示，利用IL- 1β 構建纖維環(huán)退變細胞模型后，miR-887-3p 表達水平與正常組相比顯著上升 （P<0.001）；與對照組相比，轉染 miR-887-3p抑制子后，miR-887-3p表達水平顯著下降 （P<0.001）。CCK-8法檢測結果表明，與正常組相比，對照組 細胞活力顯著下降 （P<0.001）；與對照組相比，抑制miR-887-3p的表達后，細胞增殖能力顯著增強；miR-887-3p 過 表 達 后，細 胞 增 殖 能 力 顯 著 下 降。流 式 細 胞 儀 檢 測 結 果 表 明，與 正 常 組 相 比，對 照 組 的 細 胞 凋 亡 率 顯 著 增 加 （P<0.001）；與對照組相比，miR-887-3p干擾組的細胞凋亡率顯著降低 （P<0.001），miR-887-3p過表達組 的細胞凋亡率顯著增加 （P<0.001）。蛋白質印跡法檢測結果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，對照組中Bcl-2的表達水平顯著 降低 （P<0.001），Caspase-3的表達水平顯著升高 （P<0.001）；與對照組相比，miR-887-3p干擾組中Bcl-2和MDM4 表達水平顯著升高 （P<0.01），Caspase-3的表達水平顯著降低 （P<0.01）；而miR-887-3p過表達組中Bcl-2和MDM4 表達水平顯著降低 （P<0.05），Caspase-3的表達水平顯著升高 （P<0.05）。實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡結果 顯示，干擾 miR-887-3p 后，MDM4 蛋白和 mRNA 的表達增加 （P<0.001）；過表達 miR-887-3p 后，MDM4 蛋白和 mRNA的表達降低 （P<0.01，P<0.001）。

結論 miR-887-3p可能通過調控MDM4的表達來影響大鼠椎間盤纖維環(huán) 細胞的增殖和凋亡，進而影響椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展。